吴祖光又名吴召石、吴韶。原籍江苏武进，1917年4月21日出生于北京东城小草厂的一所大宅院里，家庭为吴祖光提供了一个文学的环境。其父吴瀛，曾参加创办故宫博物院，精于诗文书画、篆刻和古文物鉴赏，对吴祖光的文学生涯有深刻影响，同年吴祖光毕业于北京孔德学校。在中法大学文学系学习一年后，应聘任南京戏剧专科学校校长室秘书。
    1934年发表的小说《宫娥怨》，是其处女作。七七事变后，随剧校到湖南、四川担任语文和中国戏剧史的教师。1936年于中法大学文科肄业。1937年，吴祖光任南京国立戏剧专科学校校长室秘书，同年创作抗日话剧《凤凰城》，成为全国戏剧界与日本侵略者进行斗争的有力武器。随后几年间，他创作了《正气歌》、《风雪夜归人》、《林冲夜奔》、《牛郎织女》和《少年游》等剧作声震剧坛。以上作品均收入《吴祖光戏剧选》。1945年，他主编的《新民晚报》副刊率先发表了毛泽东的词作《沁园春·雪》。1946年，他在上海创办《新民晚报》“夜光杯”副刊和《清明》杂志，还创作《捉鬼传》和新剧《嫦娥奔月》，声讨国民党的反动统治，后受国民党反动派的迫害逃亡香港。1947年，他在香港编导了《国魂》、《莫负青春》、《山河泪》、《春风秋雨》和《风雪夜归人》等电影。新中国成立后，吴祖光陆续创作出反映纺纱女工的电影《红旗歌》和儿童剧《除四害》等作品。1954年后，吴祖光导演了电影《梅兰芳舞台艺术》、《洛神》、《荒山泪》，为梅兰芳、程砚秋两位京剧艺术大师留下了极其珍贵的资料。1963年，他与妻子新凤霞合作改编了评剧《花为媒》，成为了评剧舞台上的成功佳作。此外他还创作了《武则天》、《三打陶三春》、《闯江湖》、《新凤霞传奇》和《三关宴》等大量作品。

1949年后吴祖光任中央电影局、北京电影制片厂导演，牡丹江文工团编导，中国戏曲学校、中国戏曲研究院、北京京剧院编剧，文化部艺术局专业创作员，中国文联委员、中国戏剧家协会常务理事、副主席，友谊出版公司名誉董事长。1957年曾被错划为右派，下放北大荒劳动。1960年回到北京，先后在中央戏曲学校实验京剧团和北京京剧团任编剧，写有《武则天》、《凤求凰》和《三打陶三春》等剧目。1979年调文化部艺术局从事专业创作。粉碎四人帮以后，写了京剧《红娘子》和话剧《闯江湖》，都颇受欢迎。他是第5届至8届全国政协委员。
    2003年4月9日，因冠心病发作，在北京逝世，享年86岁。